潑尼松ELISA檢測試劑盒

（豬牛羊組織專用）使用說明書

【測定原理】

        本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物潑尼松將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗潑尼松抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物潑尼松的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物潑尼松的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間： 45min

樣本檢測下限：

組織 ………………………………………0.3ppb

交叉反應(yīng)率：

潑尼松……………………………………100%

樣本回收率：

組織 …………………………………85%±10%

【試劑盒組成】

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 酶標(biāo)記物       7ml………………………紅色帽

4、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

5、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

6、 底物B液     7ml  …………………… 黑色帽

7、 終  止  液     7ml  …………………… 黃色帽

8、 10X濃縮洗滌液40 ml  ……………… 白色帽

9、 2X 濃縮復(fù)溶液  50ml ·………………  藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、

振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道250µl

（2）試劑：乙腈、正己烷、氯化鈉

【實驗前溶液配制】

配液1、2×復(fù)溶液：

                將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水以1：1稀釋（1份1×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水），用于樣本提取和稀釋。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（10倍濃縮）用去離子水按照 1：9稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

樣本前處理須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（1）本試劑盒適用于檢測豬牛羊組織樣本。

（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（3）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

（A）  組織樣本處理方法

1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取3±0.05g樣本于50ml離心管中，加入1g氯化鈉，再加入6ml乙腈，用振蕩器振蕩5分鐘；4000轉(zhuǎn)/分以上,室溫離心5分鐘；

2、 取上清液2ml至干凈玻璃試管中，于65℃水浴下氮氣/空氣吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml配好的1×復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心3分鐘。

4、 取50 µl下層清亮液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1  

【酶標(biāo)免疫分析程序】

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境避光反應(yīng)30分鐘。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物A液50ul，再加底物B液50ul，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含潑尼松的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

     用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.810；0.1ppb為1.450；0.3ppb為1.090；0.9ppb為0.720；2.7ppb為0.369；8.1ppb為0.208。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3ppb-0.9 ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中潑尼松實際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以金剛烷胺濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中金剛烷胺實際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）   

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

                 0.1                 0.3                 0.9                2.7                 8.1                   

        潑尼松(ppb) [µg/kg]

圖1：潑尼松檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

       0       0.1      0.3            0.9          2.7           8.1       

潑尼松(ppb) [µg/kg]

圖2：潑尼松檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出潑尼松檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)潑尼松濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、批號見外包裝。